3/1:20255

2.2.55 ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

Пептидное картирование представляет собой метод идентификации белков, особенно

получаемых с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Метод включает

химическое или ферментативное расщепление белков до образования пептидных

фрагментов с последующим их разделением и идентификацией воспроизводимым

способом. Это надежный метод испытания, позволяющий идентифицировать замену

практически любой отдельной аминокислоты, произошедшей вследствие ошибок при

транскрипции комплементарной ДНК (кДНК), или точечных мутаций. Пептидное

картирование представляет собой процедуру сравнения, поскольку сравнение полученной

информации со стандартным образцом, обработанным аналогичным образом позволяет

подтвердить первичную структуру белка, определить возможные изменения первичной

структуры в случае их наличия, подтверждает соответствие производственного процесса и

генетическую стабильность. Каждый белок обладает уникальными характеристиками,

которые должны быть хорошо изучены, чтобы научные и аналитические подходы

позволяли валидировать разработку пептидной карты, обеспечивающей достаточную

специфичность.

Данный раздел содержит детальное описание аспектов использования и валидации метода

пептидного картирования с целью получения характеристики испытуемого белка, оценки

стабильности экспрессионной системы, используемой для получения продуктов

рекомбинантной ДНК и оценки постоянства производственного процесса в целом, в

отношении, как оценки стабильности продукта, так и обеспечения идентичности белка,

либо определения содержания молекулярных вариантов белка.

Пептидное картирование не является общим методом, а заключается в составлении

индивидуальных карт для каждого отдельного белка. Хотя технологии продолжают

стремительно развиваться, существует ряд методов, которые являются общепризнанными.

При наличии определенных расхождений с данными методами они будут описаны в

соответствующих частных монографиях.

Составление пептидных карт может рассматриваться как метод получения «отпечатков

пальцев» белка, и представляет собой получаемую в результате ряда химических

процессов полную расшифровку анализируемого белка. Метод пептидного картирования

включает четыре принципиальные стадии:

− выделение и очистка белка, если он входит в состав лекарственного средства;

− избирательное расщепление пептидных связей;

− хроматографическое разделение образующихся пептидных фрагментов;

− анализ и идентификация пептидов. Испытуемый образец подвергается расщеплению и

анализу параллельно со стандартным образцом. Полное расщепление пептидных связей

более вероятно, когда вместо химических гидролизующих реагентов используются такие

ферменты, как эндопептидазы (например, трипсин).

Для того, чтобы карта была информативной, она должна содержать достаточное

количество пептидов. С другой стороны, если пептидных фрагментов будет слишком

много, карта может утратить свою специфичность, поскольку у многих белков может

оказаться аналогичный профиль.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА

Выделение и очистка необходимы при анализе готового нерасфасованного

лекарственного препарата или лекарственных средств, содержащих вспомогательные

вещества, мешающие анализу или белков-носителей, о чем, при необходимости, будут

указывать в частной монографии. Количественное извлечение белка из лекарственного

препарата должно быть валидировано.

ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПЕПТИДНЫХ СВЯЗЕЙ

Выбор подхода, используемого для расщепления пептидных связей зависит от

испытуемого белка. Процедура выбора включает определение типа расщепления

(химического или ферментативного), а также типа протеолитического реактива в рамках

выбранной категории.

В таблице 2.2.55.-1 приведен ряд протеолитических реактивов и параметры их

специфичности. Данный список не является исчерпывающим и будет дополнен по мере

определения других реактивов, способных расщеплять пептидные связи.

Таблица 2.2.55.-1. − Примеры реагентов для расщепления пептидных связей

Тип

Реактив

Специфичность

Ферментативные

Трипсин (ЕС 3.4.21.4)

Химотрипсин (ЕС 3.4.21.1)

Пепсин (ЕС 3.4.23.1 и 2)

Лизилэндопептидаза (Lys-C

эндопептидаза) (ЕС 3.4.21.50)

Глутамилэндопептидаза (из S.aureus

штамм V8) (ЕС 3.4.21.19)

Пептидил-Asp метало-эндопептидаза

(эндопротеазаAsp-N)

Клострипаин (ЕС 3.4.22.8)

С-концевые аргинин и лизин

С-концевые гидрофильные остатки

(например, лейцин, метионин,

аланин, ароматические

аминокислоты)

Неспецифический фермент

С-концевой лизин

С-концевые глутамин и аспарагин

N-концевой аспарагин

С-концевой аргинин

Химические

Цианобромид

2-Нитро-5-тио-цианобензойная

кислота

О-Иодозобензойная кислота

Разбавленная кислота

С-концевой метионин

N-концевой цистеин

С-концевые триптофан и тирозин

Аспарагин и пролин

Триптофан

BNPS-скатол (3-бром-3-метил-2-[(2-

нитро-фенил)сульфанил]-3H- индол)

Предварительная обработка испытуемого образца. В зависимости от размера или

конфигурации белка используют различные подходы к предварительной обработке

испытуемого образца. Если для расщепления пептидных связей белка с молекулярной

массой более 100000 Да используют трипсин, остатки лизина должны быть защищены

путем получения производных с цитраконовым или малеиновым ангидридами, так как в

противном случае может образоваться слишком много пептидных фрагментов.

Предварительная обработка расщепляющего реагента. Предварительная обработка

расщепляющего реагента, особенно ферментов, может быть необходима для обеспечения

требуемой чистоты и воспроизводимости пептидной карты. Например, трипсин,

используемый в качестве реагента для расщепления пептидных связей, следует

обработать тозил-L-фенилаланинхлорметилкетоном для инактивации химотрипсина.

Другие методы, например, очистка трипсина с помощью высокоэффективной жидкостной

хроматографии (ВЭЖХ) или иммобилизация фермента на гелевом носителе, успешно

используют, особенно при ограниченном количестве целевого белка.

Предварительная обработка белка. При определенных условиях может потребоваться

концентрирование испытуемого образца или отделение белка от используемых в готовом

продукте вспомогательных веществ и стабилизаторов, если они мешают процедуре

картирования. Физические процедуры, используемые для предварительной подготовки,

могут включать ультрафильтрацию, колоночную хроматографию и лиофилизацию. С

целью проведения денатурации белка до процедуры пептидного картирования возможно

использование других методов подготовки, таких как добавление хаотропных агентов

(например, мочевины). Для обеспечения полного доступа фермента к местам разрыва

связей и частичной денатурации белка, часто до проведения протеолитического

расщепления необходимо восстановление и алкилирование дисульфидных связей.

Расщепление пептидных связей с использованием трипсина может вызвать в пептидной

карте ряда неточностей, из-за побочных реакций протеолитического расщепления, таких

как неспецифическое расщепление, дезамидирование, дисульфидная изомеризация,

окисление остатков метионина, образование пироглутаминовых групп при

дезамидировании глутамина на N-концевой стороне пептида. Более того, при

автогидролизе трипсина также могут появляться дополнительные пики. Интенсивность их

образования зависит от соотношения содержания трипсина к белку. Для предотвращения

автогидролиза растворы протеаз могут быть приготовлены при значении рН, отличном от

оптимального значения (например, при рН 5 для трипсина), благодаря чему фермент не

перейдет в активное состояние до момента разведения с буферным раствором при

проведении расщепления.

Установление оптимальных условий для расщепления пептидных связей. Факторы,

которые влияют на полноту и эффективность расщепления протеинов, являются

факторами, оказывающими влияние на химические и ферментативные реакции.

рН реакционной среды. Значение рН смеси, в которой осуществляется расщепление

пептида, определяют эмпирически, что обеспечивает оптимизацию состояния

расщепляющего реагента. Например, при использовании бромциана в качестве

расщепляющего реагента необходимым является создание сильнокислой среды

(например, рН 2, муравьиная кислота); однако, при использовании трипсина в качестве

расщепляющего реагента оптимальной является слабощелочная среда (рН 8). В целом,

значение рН реакционной среды не должно изменять химическую структуру белка в ходе

реакции расщепления и не должно изменяться в ходе проведения реакции фрагментации.

Температура. Для большинства реакций расщепления наиболее подходящей является

температура в интервале от 25 °С до 37 °С. Используемая температура должна

способствовать минимизации побочных химических реакций. Тип испытуемого белка

определяет выбор температуры реакционной среды, поскольку некоторые белки с

повышением температуры склонны к денатурации. Например, расщепление

рекомбинантного бычьего соматропина проводится при температуре 4 °С, поскольку при

более высокой температуре он осаждается в ходе проведения реакции расщепления.

Время. В случае если имеется достаточное количество испытуемого образца, следует

провести испытание по определению времени, являющегося оптимальным для получения

воспроизводимой карты и достаточным для проведения полного расщепления.

Продолжительность расщепления варьирует от 2 ч до 30 ч. Реакцию прекращают либо

прибавлением кислоты, которая не оказывает влияния на полученную пептидную карту,

либо замораживанием.

Количество используемого расщепляющего реагента. Для обеспечения достаточного

быстрого расщепления (от 6 ч до 20 ч) используют избыточное количество

расщепляющего реагента; тем не менее, его количество должно быть минимизировано,

чтобы предотвратить вклад реагента в структуру пептидной карты. Обычно испытуемый

протеин и реагент берут в соотношении 20 : 1 или 200 : 1. Для оптимизации процедуры

расщепления рекомендуется добавлять расщепляющий агент в два или более этапов. При

этом конечный объем реагирующей смеси должен оставаться достаточно небольшим для

обеспечения следующего этапа пептидного картирования — разделения. Для того, чтобы

исключить возможное влияние искажающих продуктов расщепления (артефактов) на

результаты последующего анализа, проводят контрольное определение со всеми

реагентами за исключением анализируемого белка.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ

Для картирования используют различные методы разделения белков. Выбор метода

зависит от белка, для которого составляется пептидная карта. В таблице 2.2.55.−2

перечислены методы, успешно используемые для разделения пептидов. В данном разделе

приведено описание метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной

хроматографии (ВЭЖХ), одного из наиболее часто используемых методов

хроматографического разделения.

Критическими факторами при ВЭЖХ разделении являются чистота растворителей и

подвижной фазы. Для проведения обращенно-фазовой ВЭЖХ рекомендуется

использование растворителей и воды степени чистоты «для ВЭЖХ». Растворенные газы

являются проблемой для градиентных систем в тех случаях, когда растворимость газа в

растворителе может быть меньше в смеси, чем в самом растворителе. В качестве

эффективного способа дегазации может быть использована вакуумная дегазация и

воздействие ультразвуком. В случае, если твердые частицы в растворителе попадут в

хроматографическую систему, они могут нарушить герметичность клапанов насоса или

засорить верхнюю часть хроматографической колонки. В связи с этим рекомендуется

проведение фильтрации до и после насоса.

Таблица 2.2.55.−2. − Методы, используемые для разделения пептидных фрагментов

Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

Ионообменная хроматография

Хроматография гидрофобного взаимодействия

Электрофорез в полиакриламидном геле, неденатурирующий

Электрофорез в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом

Капиллярный электрофорез

Бумажная электро-хроматография

Высоковольтный электрофорез на бумаге

Хроматографическая колонка. Для каждого белка выбор колонки осуществляется

эмпирически. Колонки с размером пор от 10 нм до 30 нм, заполненные сорбентом на

основе силикагеля, могут обеспечить оптимальное разделение. Для небольших пептидов

неподвижные фазы силикагель октилсилильный для хроматографии Р (3–10 мкм) и

силикагель октадецилсилильный для хроматографии Р (3–10 мкм) в качестве

наполнителей колонки являются более эффективными, чем силикагель бутилсилильный

для хроматографии Р (5–10 мкм).

Растворитель. Наиболее часто используемым растворителем является вода с

ацетонитрилом в качестве органического модификатора с добавлением не более 0.1 %

трифторуксусной кислоты. При необходимости, для солюбилизации компонентов

гидролизата, добавляют пропанол или 2-пропанол, при условии, что их добавление не

приведет к чрезмерному повышению вязкости компонентов.

Подвижная фаза. Подвижную фазу, содержащую фосфатный буфер, используют для

обеспечения возможности выбора рН, поскольку изменение рН в интервале от 3.0 до 5.0

улучшает разделение пептидов, содержащих кислотные остатки (например, глутаминовая

и аспарагиновая кислоты). Натрия или калия фосфаты, ацетат аммония, фосфорная

кислота при значении рН между 2 и 7 (или выше при использовании полимерного

наполнителя) используют с ацетонитрильным градиентом. Достаточно часто используют

ацетонитрил с трифторуксусной кислотой.

Градиент. Градиент может быть линейным, нелинейным или включать ступенчатое

изменение состава. Для разделения сложных смесей рекомендуется пологий градиент.

Градиент оптимизируют, добиваясь четкого разрешения с 1 или 2 пиков, которые

становятся «маркерными» пиками для испытания.

Изократическое элюирование. Изократическую ВЭЖХ с использованием подвижной

фазой постоянного состава используют ввиду ее удобства и улучшенного аналитического

сигнала детектора. В ряде случаев сложно подобрать оптимальный состав подвижной

фазы, позволяющий добиться хорошего разрешения для каждого пика. Для проведения

изократической ВЭЖХ не должны использоваться подвижные фазы, для которых

незначительное изменение в соотношении компонентов или значение рН существенно

влияет на время удерживания пиков на пептидной карте.

Другие параметры. Для достижения хорошей воспроизводимости, как правило,

необходим контроль температуры колонки. Скорость подвижной фазы варьирует от 0.1

мл/мин до 2.0 мл/мин, детектирование пептидов осуществляют спектрофотометрическим

детектором при длине волны от 200 нм до 230 нм. Используют и другие методы

детектирования (например, постколоночная дериватизация), но они не столь надежны и

универсальны, как детектирование в ультрафиолетовой области.

Валидация. В данном разделе приведены экспериментальные средства для оценки общих

характеристик используемого метода. Критерии оценки пригодности системы зависят от

определения критических параметров испытания, влияющих на интерпретацию данных и

их приемлемость. Критические параметры являются также критериями, по которым

производится контроль расщепления и анализа пептидов. Для контроля полноты

требуемого расщепления используется сравнение со стандартным образцом, который был

подвергнут такому же воздействию, как и испытуемый белок. Использование

стандартного образца параллельно с испытуемым белком является критическим при

разработке и установлении значений критериев пригодности системы. Кроме этого, с

целью дополнительного сравнения включают образец хроматограммы стандартного

образца. Другие показатели могут включать визуальный контроль растворимости белка

или пептидов, отсутствие интактного белка, измерение откликов трудно расщепляемых

пептидов. Критические параметры оценки пригодности системы для пептидного анализа

будут зависеть от конкретного используемого метода разделения и детектирования, а

также требований к получаемым в результате анализа данным.

Если пептидное картирование используют в качестве испытания по идентификации,

требования к пригодности системы для испытуемых пептидов включают избирательность

(селективность) и воспроизводимость (прецизионность). В этом случае, также как и при

идентификации молекулярных вариантов белка, определение первичной структуры

пептидных фрагментов при картировании обеспечивает как верификацию известной

первичной структуры, так и идентификацию структуры вариантов белка путем сравнения

с пептидной картой стандартного образца испытуемого белка. Подходящим методом для

определения разделения пептидов и аминокислот является использование подвергнутого

расщеплению стандартного образца испытуемого белка. Для анализа молекулярных

вариантов белка может быть использована охарактеризованная по составу смесь

вариантов белка и стандартного образца, в особенности, если варианты белка находятся в

зоне наименьшего разрешения на пептидной карте. Показателем пептидной

последовательности может быть количество основных обнаруженных пептидов. Лучше

всего пептидную последовательность определять разрешением пиков пептидов.

Хроматографические параметры, такие как разрешение между пиками, ширина пика у

основания, площадь пика, степень размывания заднего фронта пика и эффективность

колонки, могут быть использованы для определения разрешения пептидов. В зависимости

от испытуемого белка и используемого метода разделения могут устанавливаться

требования к разрешению одного или нескольких пептидов.

Повторный анализ продуктов расщепления стандартного образца для испытуемого белка

позволяет установить количественные характеристики прецизионности и открываемости.

Открываемость определяемых пептидов в целом устанавливают при помощи внутренних

и внешних пептидных стандартов. Воспроизводимость (прецизионность) выражают как

относительное стандартное отклонение. Следует ожидать различий в открываемости и

воспроизводимости (прецизионности) идентифицируемого протеина; следовательно,

критерии допуска для оценки пригодности системы должны быть установлены как для

открываемости, так и для воспроизводимости (прецизионности) идентифицируемых

пептидов. Установленные критерии допуска являются специфическими для конкретного

белка и указываются в частной монографии.

Визуальное сравнение относительного времени удерживания, параметров пиков (площади

пика или высоты пика), числа пиков и, в целом, метода элюирования выполняют на

начальном этапе. Сравнение дополняют и подтверждают математическим анализом соот-

ношений анализируемых параметров пиков и хроматографического профиля смеси 1:1

(об/об) продуктов расщепления испытуемого образца и стандартного образца.

Идентичность испытуемого образца подтверждается, если все пики продуктов

расщепления испытуемого белка и стандартного образца имеют аналогичные

относительные времена удерживания и соотношения оцениваемых параметров пиков.

Если пики, которые изначально характеризовались значительно различающимися

относительными временами удерживания, затем, в смеси 1:1(об/об) обнаруживались

единым пиком, изначально выявленное различие указывает на нестабильность системы.

Однако, если в смеси 1:1(об/об) наблюдаются разделенные пики, это является доказа-

тельством наличия различных пептидов в каждом из пиков. Если пик в смеси 1:1(об/об)

существенно шире, чем соответствующий пик в испытуемом белке и стандартном

образце, это может указывать на присутствие различных пептидов. Было предложено

использование компьютерной программы распознавания для анализа данных пептидного

картирования, однако некоторые аспекты валидации программного обеспечения

исключают ее использование в фармакопейных испытаниях в ближайшем будущем.

Использовались также другие автоматизированные подходы с использованием

математических формул, моделей и систем распознавания. Одним из таких подходов,

например, является автоматическое определение соединений методом ИК-спектроскопии

и применение диодно-матричного УФ-спектрального анализа для идентификации

пептидов. Данные методы имеют ограничения, обусловленные недостаточным

разрешением, одновременным элюированием фрагментов, различиями в абсолютных

значениях параметров пиков между продуктами расщепления анализируемого и

стандартных образцов.

Можно произвести множественное сравнение времен удерживания и площадей или

высоты пиков для выбранной группы соответствующих пиков, которые правильно

идентифицируются на пептидной карте. Площади пиков могут быть рассчитаны с

использованием одного пика, демонстрирующего относительно небольшую

вариабельность в качестве внутреннего стандарта, с учетом того, что интегрирование

площади пика является чувствительным к базовой вариабельности и может служить

причиной ошибки испытания. Как альтернативный вариант для испытуемого образца

может быть рассчитан процент высоты пика каждого пептида относительно суммы

высоты всех пиков. Затем полученный процент сравнивают со значением аналогичного

параметра соответствующего пика стандартного образца. Возможность аутогидролиза

трипсина контролируют при помощи создания пептидной карты-плацебо, получаемой при

обработке трипсином раствора без испытуемого белка.

Минимальным требованием для оценки качества пептидного картирования является

принятая процедура тестирования, которая включает пригодность системы в качестве

контроля.

В целом, на начальном этапе регуляторного процесса качественный анализ пептидной

карты испытуемого белка является достаточным. По мере продвижения процесса

регуляторного одобрения белков дополнительные испытания по оценке качества могут

включать частичную валидацию аналитической процедуры для подтверждения

применимости и воспроизводимости методики при разработке пептидной карты

испытуемого белка.

АНАЛИЗ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЕПТИДОВ

В данном разделе приведены рекомендации по использованию пептидного картирования

при разработке частных монографий и нормативных документов по качеству при

регистрации лекарственных средств.

Использование пептидной карты как инструмента качественного определения не требует

полной характеристики индивидуальных пептидных пиков. Однако, валидация методики

пептидного картирования при разработке частных монографий и нормативных

документов по качеству требует подробной характеристики каждого из индивидуальных

пиков пептидной карты. Для характеристики индивидуальных пиков могут быть

использованы метод N-концевого секвенирования с последующим анализом аминокислот

и метод с использованием масс-спектроскопии.

Для составления характеристики пиков с использованием N-концевого секвенирования и

аминокислотного анализа проводят масштабирование стадии аналитического разделения.

Необходимо убедиться, на основании экспериментальных данных, что ухудшения

разрешения между пиками после проведения масштабирования не происходит. Элюаты,

соответствующие специфическим пептидным пикам, собирают, концентрируют в вакууме

и, при необходимости, повторно хроматографируют. Аминокислотный анализ фрагментов

может быть ограничен размером пептидов. В случае если N-конец аминокислоты

заблокирован, может потребоваться его высвобождение до секвенирования. С целью

получения характеристики может также использоваться С-концевое секвенирование

белков в комбинации с карбоксипептидазой и методом матрично-активированной

лазерной десорбции/ионизации с времяпролетным масс-анализатором.

Использование масс-спектроскопии для характеристики пептидных фрагментов

производят либо путем непосредственного введения выделенных пептидов, либо с

использованием on-line системы ВЭЖХ с масс-спектрометром для структурного анализа.

В целом, структурный анализ он включает электрораспыление и масс-спектрометрию

методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с времяпролетным

масс-анализатором, а также бомбардировку быстрыми атомами. Тандемную масс-

спектроскопию также используют для определения последовательности

модифицированных белков и типа произошедшей аминокислотной модификации.

Сравнение масс-спектров продуктов гидролиза до и после восстановления обеспечивает

определение расположения дисульфидных связей в различных сульфгидрилсодержащих

пептидах.

Если некоторые участки первичной структуры не могут быть достаточно четко отражены

пептидной картой, может потребоваться составление вторичной пептидной карты. Целью

валидированной методики для характеристики белка посредством пептидного

картирования является определение не менее 95 % теоретической структуры белка.